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       化妝品挑戰(zhàn)性試驗(yàn)就是用來(lái)測(cè)定防腐劑有效抗菌的最低濃度,是用來(lái)決定化妝品配方中防腐劑的用量,無(wú)論是化妝品新配方的開(kāi)發(fā)或現(xiàn)有的產(chǎn)品,以及新防腐劑的開(kāi)發(fā)使用,均應(yīng)作防腐效能試驗(yàn)。防腐效能試驗(yàn)是在化妝品樣中加入微生物,根據(jù)微生物的存活和增減的數(shù)量來(lái)判定所加防腐劑的量是否合適。

        所有的化妝品在生產(chǎn)和消費(fèi)者使用過(guò)程中都面臨著受到微生物污染的可能。大多數(shù)化妝品的制造原材料不是無(wú)菌的,但生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有采用無(wú)菌程序,沒(méi)有滅菌過(guò)程,而且常常裝在多次使用過(guò)的包裝容器內(nèi),這就可能造成微生物的一次污染。大多數(shù)化妝品具體營(yíng)養(yǎng)成分和水分利于微生物生長(zhǎng)和繁殖的條件,當(dāng)有足夠的水分和營(yíng)養(yǎng)成分存在時(shí),產(chǎn)品除非有適宜的防腐劑存在,否則微生物將會(huì)迅速繁殖,脫水產(chǎn)品如眼影、粉底、礦物油等雖然沒(méi)有微生物生長(zhǎng)所必需的水分,但它們?cè)诜磸?fù)的使用過(guò)程中都有被二次污染的可能。二次污染是很難避免的,只能從加強(qiáng)防腐能力和減少細(xì)菌入侵著手,如選擇合適的防腐體系、封閉良好的包裝。產(chǎn)品的微生物污染不僅影響產(chǎn)品的功能和穩(wěn)定性,而且最重要的是影響使用時(shí)的安全性,使用污染了的產(chǎn)品會(huì)給消費(fèi)者造成健康威脅，因此在化妝品中常添加不同種類的防腐劑來(lái)防止微生物的大量繁殖,化妝品中防腐劑的存在減少了微生物存在的幾率。

主要檢測(cè)方法

CTFA法

CIFA法用微生物包括:G+球菌如金黃色葡萄球菌;G-桿菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌;霉菌如黑曲霉、白色念珠菌。另外需氧產(chǎn)芽孢菌如蠟芽孢桿菌和枯草芽孢桿蘭等可選用。CIFA使用的細(xì)蘭培養(yǎng)基包括NA、TSA(水解大豆瓊開(kāi)培養(yǎng)基)、EA(瓊脂培養(yǎng)基)。適宜于真蘭生長(zhǎng)的培養(yǎng)包括PDA(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)或MA(瓊脂培養(yǎng)基)。當(dāng)菌體生長(zhǎng)好后,可將細(xì)菌或酵母菌于5℃下斜面保存,霉菌可在室溫下斜面保存。在準(zhǔn)備接種物時(shí),可以用肉湯或瓊培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌和酵母菌,收獲的菌體用于微生物檢驗(yàn)。在進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí),一般取20g或20mL樣品,微生物的接種濃度控制在1x10°CUmL(或g)產(chǎn)物,眼部用品酵母菌和菌濃度1x10CFU/mL(或g)產(chǎn)物。為了獲得每種或每類群微生物的試臉數(shù)據(jù),CTFA傾向于使用純培養(yǎng)物或相當(dāng)類似的微生物來(lái)接種,體積不應(yīng)超過(guò)總體積的1%,這些檢驗(yàn)水平提供了比通常消費(fèi)者使用可能性更高的細(xì)菌污染機(jī)會(huì)。加之,在產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)許多產(chǎn)品還有保護(hù)性體系,即加入略多一些的防腐劑,因此,大多數(shù)經(jīng)檢驗(yàn)后確定的防腐劑濃度保證了品可以在消費(fèi)者使用期間抵抗污染。一般來(lái)講細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為35-37℃,真菌采用23-28℃培養(yǎng)。CTFA推薦混合測(cè)試的樣品分別于0、1、23天(僅用于眼部的化妝品)、7、14和28天觀察微生物的生長(zhǎng)情況，有部分檢驗(yàn)可能多于28天。有些產(chǎn)品還進(jìn)行重復(fù)性的防腐試驗(yàn)來(lái)估計(jì)防腐劑在產(chǎn)中的適應(yīng)性,用某一特定的微生物防腐試驗(yàn)可以得出使防腐系統(tǒng)失去效力所需的檢驗(yàn)次數(shù)。CTFA所推薦的含有中和劑的稀培養(yǎng)基有:LBL,LBLT,TGB或WB。當(dāng)使用傾注平板法培養(yǎng)時(shí),加人培養(yǎng)基中的卵磷脂或吐溫-80就可以中和大多數(shù)防腐劑,并使產(chǎn)品均勻分布,對(duì)細(xì)菌、酵母和真菌來(lái)講Letheen瓊脂培養(yǎng)基是最常使用的培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基還適用于厭氧菌的生長(zhǎng),對(duì)于中和季銨鹽類化合物十分有效。其他的CTFA推薦的培養(yǎng)基有:TSA、NA、,TA、EA、TCG-YEA、D-E培養(yǎng)基以及 TSAPL，其他還有使真菌富集的培養(yǎng)基,如右旋葡萄糖瓊脂, Mycophil瓊脂, Mycological瓊脂和 Eugen-gr。如果防腐劑是汞或其他重金屬,則應(yīng)采用硫代乙醇酸的培養(yǎng)基。

USP法

USP所用的微生物包括:金黃色葡萄球菌(ATcC6538)、大腸桿菌(ATCC8739)、鋼綠假單胞菌(ATC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉( ATCC6404)。USP采用的培養(yǎng)基是SCDA(大豆酪蛋白消化性瓊脂培養(yǎng)),因?yàn)樗梢允刮⑸锿⒌厣L(zhǎng)。故USP方法建議用此培養(yǎng)基來(lái)活化菌種。將保存的菌種在固體培養(yǎng)基上接種。細(xì)菌的培養(yǎng)在35℃下培養(yǎng)18~24h,酵母在20~25℃下培養(yǎng)48h,絲狀真菌在20-25℃下培養(yǎng)一周,菌種培養(yǎng)后用無(wú)菌生理鹽水收集細(xì)菌和酵母菌體,并將其稀釋到1×103cFU/mL,絲狀真菌用含0.05%吐溫-80的無(wú)菌水收集并將孢子濃度調(diào)至1×10CFUmL。由于菌懸液的濃度決定了試驗(yàn)中的接種量,因此,應(yīng)控制好菌液的濃度。另外,菌懸液制備好后應(yīng)立即使用,否則將影響菌懸液中菌體的存活性。當(dāng)產(chǎn)品的包裝容器不能進(jìn)行接種和無(wú)菌取樣時(shí),應(yīng)取20mL的產(chǎn)品至一個(gè)無(wú)菌的帶蓋的細(xì)菌試管中,以0.01mL的接種液:20mL試驗(yàn)樣品的比例進(jìn)行接種接種液中的微生物濃度應(yīng)控制在1x103-1×10°CF/mL之間,接種后在20~25℃下培養(yǎng),微生物的計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法來(lái)確定。以這個(gè)數(shù)來(lái)計(jì)算產(chǎn)品中的初始菌體濃度。并于第7,14,28天分別進(jìn)行檢測(cè),并計(jì)算APC,試驗(yàn)者可根據(jù)初始菌體濃度,計(jì)算出APC的變化。根據(jù)這種方法,一種有效的防腐體系可以在14天后將細(xì)菌生存數(shù)減至初始濃度的0.1%,酵母和霉菌生存水平可能會(huì)更低。在試驗(yàn)后期階段,必須低于或維持這些既定的水平。

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

USP認(rèn)為如果產(chǎn)品能做到以下幾個(gè)方面就說(shuō)明防腐劑系統(tǒng)有效：

1. 在14天內(nèi)存活菌數(shù)達(dá)到初始菌數(shù)的0.1%;

2. 酵母菌和霉菌沒(méi)有菌絲生長(zhǎng);

3. 在28天保存試驗(yàn)中所有測(cè)試的微生物都保持或低于所設(shè)計(jì)的微生物水平。

CTFA的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為如果產(chǎn)品能做到以下幾個(gè)方面,就說(shuō)明防腐劑系統(tǒng)有效：

1. 在測(cè)試樣品保存7天內(nèi)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)減少99.9%以上,并在試驗(yàn)期間繼續(xù)減少;

2. 酵母蘭和曹應(yīng)減少90%以上,并在試驗(yàn)期間繼續(xù)減;

3. 在整個(gè)試驗(yàn)期間可抑制芽孢的萌發(fā)。

       上述兩種防腐效能試驗(yàn)方法,為防腐效能試驗(yàn)方法的選擇提供了參考,但防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)在國(guó)際上并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合找到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)際情況的關(guān)聯(lián),從企業(yè)的現(xiàn)狀選擇方法,不失為一種很好的選擇。